潔凈度（沉降菌）的檢驗標準操作規程

1 目的

   建立潔凈度（沉降菌）的檢驗標準操作規程，為沉降菌檢查人員提供正確的標準操作方法。

2 范圍

適用于本公司潔凈度（沉降菌）檢查的全過(guò)程。

3 責任

QA對本規程的有效執行承擔監督檢查責任，QC對本規程的實(shí)施負責。

4 程序

4.1概述：本標準對塵粒及微生物污染規定需進(jìn)行環(huán)境控制的房間或區域。其建筑結構、裝備及其使用均具有減少對該區域內污染源的介入、產(chǎn)生和滯留的功能。

4.2測試方法

4.2.1方法提要：

     本標準按國家技術(shù)監督局發(fā)布的《醫藥工業(yè)潔凈室（區）沉降菌的測試方法》，采用沉降法，即通過(guò)自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿，經(jīng)若干時(shí)間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見(jiàn)的菌落進(jìn)行計數，以平板培養皿中的菌落數來(lái)判定潔凈環(huán)境內的活微生物數，并以此來(lái)評定潔凈室（區）的潔凈度。

4.2.2儀器

     儀器包括：培養皿、培養基、恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌器。

4.2.2.1培養皿

       一般采用f90mm×15mm規格的培養皿。

4.2.2.2培養基

       大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）或沙氏培養基（SDA）或用戶(hù)認可并經(jīng)驗證了的培養基。

4.3測試前的規則：

4.3.1測試狀態(tài)；

4.3.1.1沉降菌測試前，被測試潔凈室（區）的溫濕度須達到規定的要求，靜壓差、換氣次數、空氣流速必須控制在規定值內。潔凈室（區）的溫度和相對濕度應與其生產(chǎn)及工藝要求相適應（無(wú)特殊要求時(shí)，溫度在18℃～26℃，相對濕度在45%～65%之間為宜），同時(shí)應滿(mǎn)足測試儀器的使用范圍。

4.3.1.2沉降菌測試前，被測試潔凈室（區）已經(jīng)過(guò)消毒。

4.3.1.3測試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，測試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報告中注明測試狀態(tài)。

4.3.1.4靜態(tài)測試時(shí)，培養皿暴露時(shí)間為30min以上；動(dòng)態(tài)測試時(shí)，培養皿暴露時(shí)間為不大于4h。

4.3.2測試人員：

4.3.2.1測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。

4.3.2.2靜態(tài)測試時(shí)，室內測試人員不得多于2人。

4.3.3測試時(shí)間：

4.3.3.1對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調系統正

常運行不少于10min后開(kāi)始。

4.3.3.2對非單向流，如B級、B級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統正常運行不少于30min后開(kāi)始。

4.3.4注意事項：

4.3.4.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。

4.3.4.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。

4.3.4.3對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。

4.3.4.4由于細菌種類(lèi)繁多，差別甚大，計數時(shí)一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀(guān)察，不要漏計培養皿邊緣生長(cháng)的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。

4.3.4.5采樣前應仔細檢查每個(gè)培養皿的質(zhì)量，如發(fā)現變質(zhì)、破損或污染的應剔除。

4.3.4.6對于單向流潔凈室（區）或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝向應正對氣流方向；對于非單向流（區），采樣口向上。

4.3.4.7布置采樣點(diǎn)時(shí)，至少應盡量避開(kāi)塵粒較集中的回風(fēng)口；采樣時(shí)，測試人員應站在采樣口的下風(fēng)側，并盡量少走動(dòng)。

4.3.4.8培養皿在用于檢測時(shí)，為避免培養皿運輸或搬動(dòng)過(guò)程造成的影響，宜同時(shí)進(jìn)行對照試驗，每次或每個(gè)區域取1個(gè)對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養皿（TSA或SDA）一起放入培養箱內培養，結果應無(wú)菌落生長(cháng)。

4.4測試步驟：

4.4.1采樣方法：

4.4.1.1儀器和用具：培養皿。

4.4.1.2方法：

a采樣點(diǎn)一般在離地面0.8m高度的水平面上均勻布置。

b采樣點(diǎn)多于5點(diǎn)時(shí)，也可以在離地面0.8m～1.5m高度的區域內分層布置，但每層不少于5點(diǎn)。

c打開(kāi)培養皿蓋，使培養基表面暴露0.5h，再將培養皿蓋蓋上后倒置。

                            最少采樣點(diǎn)數目

最少培養皿數

4.4.2培養：

4.4.2.1儀器和用具：培養箱、天平（萬(wàn)分之一）、稱(chēng)量紙、錐形瓶（1000ml、150ml）、量筒（1000ml）、高壓蒸汽滅菌鍋。

4.4.2.2培養基：

4.4.2.2.1大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）：

a） 成分：酪蛋白胰酶消化物 15g    大豆粉木瓜蛋白酶消化物  5g    氯化鈉  5g    瓊脂  15g    純化水   1000ml

b） 制法：取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節pH值使滅菌后為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無(wú)菌操作要求下傾注約20ml至無(wú)菌平皿（f90mm）中。加蓋后在室溫放至凝固。

4.4.2.2.2沙氏培養基（SDA）：

     a）葡萄糖   40g    酪蛋白胰酶消化物、動(dòng)物組織的胃酶消化物等量混合  10g     瓊脂  15g      純化水   1000ml

b）制法：取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節pH值使滅菌后為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無(wú)菌操作要求下傾注約20ml至無(wú)菌平皿（f90mm）中。加蓋后在室溫放至凝固。

4.4.2.3方法：全部采樣結束后，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養，采用大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）配制的培養皿在30～35℃培養箱中培養，時(shí)間不少于2天；采用沙氏培養基（SDA）配制的培養皿在20～25℃培養箱中培養，時(shí)間不少于5天。每批培養基應有對照試驗，檢驗培養基本身是否污染。可每批選定3只培養皿作對照培養。

4.4.3菌落計數：

4.4.3.1用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點(diǎn)計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

4.4.3.2若培養皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計數。

4.4.4結果計算：

4.4.4.1用計數方法得出各個(gè)培養皿的菌落數。

4.4.4.2平均菌落數的計算，見(jiàn)式。

                             M1+M2+…+Mn   

平均菌落數M=   

                                 n

式中 M—平均菌落數；

               M1—1號培養皿菌落數；

               M2—2號培養皿菌落數；

               Mn—n號培養皿菌落數；

               n—培養皿總數。

4.4.5結果評定：

     用平均菌落數判斷潔凈室（區）空氣中的微生物。

4.4.5.1潔凈室（區）內的平均菌落數必須低于所選定的評定標準。

4.4.5.2在靜態(tài)測試時(shí)，若某潔凈室（區）內的沉降菌平均菌落數超過(guò)評定標準，則必須對此區域先進(jìn)行消毒，然后重新采樣兩次，測試結果均須合格。